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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷过酸修饰语组学、LC-MS/MS磷过酸位点研究分析技术服务。
日语微信标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
简体中文主题词：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
的客户公司的：山东大学
调查的材料：拟南芥侧根
拜谱提高技术水平：磷碱化绘制组学、LC-MS/MS磷碱化位点研究
科研指导思想：
PART 01 的研究报告单
01、滋生素促使VIK的磷碱化简答转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷酸性反应淀粉酶质类物质析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 发育素有利于促进VIK的磷过酸举例说明转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷酸性反应工作。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酵母粉双交配概述（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补性显像研究（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体外磷过酸实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时交通降钙素原检测PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素信息乐观改善 LR 大
用讲解3个VIK T-DNA放入变化体（vik-2和vik-3），出现与纯天然型相对，变化体的LR体积密度单位、LR原基（LRP）和已成长的LR可观增多，针对是vik-2（图2）。相同，过表示爱VIK的转基因水稻遗传食品组主茎行为出LR体积密度单位曾加。不仅而且，在vik-2变化体背静下表示爱VIK的转基因水稻遗传食品组主茎治愈了LR成长问题。发芽素进行处理实验操作表示，vik-2变化体对发芽素诱导性的LR成长体现减退，表示VIK在发芽素监测LR成长中挥发关键因素功效。 
图2 VIK介导的生长的素数据信息径路正面调整LR的大
03、VIK 与ERF13 对其进行力学通讯
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双碳原子荧光同质 （BiFC）和免疫细胞共析出科学试验（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13之间角色
04、VIK以双面馈的方试调节作用ERF13磷过酸
通过磷硝化作用蛋清组学了解，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点变异会发现显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈办法磷过酸ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷碱化有利于促进ERF13吸附
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过休外实践和里面实践，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸虚拟仿真和磷酸灭活甲基化体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚血细胞定位系统分折表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷酸性反应快速了ERF13化学降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷碱化上下调整 LR 的出显
的研究进1步刍议了VIK管控的ERF13溶解在侧根（LR）发展中的做用。能够相对与众有差异转DNA作物系的LR表型，察觉到过体现ERF13调节了LR的产生，在vik突变的体中这调节做用资料，而在过体现YFP-VIK的原型下这调节做用弱化（图6）。再者，相对ERF13的与众有差异磷酸性反应模仿机和磷酸解离基因变异体的过体现作物系，察觉到ERF132A-Myc（磷酸解离）的作物系LR产生减少，而ERF132D-Myc（磷酸性反应模仿机）的作物系LR产生略多。等等数据体现了，VIK介导的ERF13磷酸性反应和溶解有利于促进了LR的产生。 
图6 VIK介导的ERF13磷碱化增强LR的现身
07、VIK在侧根生长中磷酸性反应并稳定的LBD18蛋白质
依据解析多个VIK T-DNA导入突然变化体（vik-2和vik-3），出现 与也是型相比较，突然变化体的侧根（LR）体积容重、LR原基（LRP）和已大的LR取得变少，非常是vik-2（图7）。相反的成语，过取决于VIK的转什么是什么是基因植物体症状出LR体积容重增高。还有就是，在vik-2突然变化体环境下取决于VIK的转什么是什么是基因植物体恢复过来了LR大偏差。成长素解决科学试验取决于，vik-2突然变化体对成长素诱发的LR大不起使用减少，取决于VIK在成长素调整LR大中挥发根本使用。 
图7 VIK 在LR造成期间中直接的磷酸性反应和平衡LBD18蛋白酶
PART 02 原创文章个人心得体会
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷碱化淀粉酶质组学剖析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的繁殖素讯号自动调节侧根导致
PART 03 拜谱工作小结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的核氨基酸组学、遮盖核氨基酸组学、新陈代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—非常高广度DIA·磷硝化作用呈现组，采用创新丰度技术工艺+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现家禽样例10w+、树木样例5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
选取文献资料：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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